NAIST、iPS細胞などの移植後腫瘍化の発生確率を抑制する技術を開発
奈良先端科学技術大学院大学(NAIST)は、iPS細胞やES細胞などが持つ多能性に不可欠なタンパク質「EPHA2」を発見し、同タンパク質は一部が細胞の外側に突き出していることから、それを指標にすることで、移植細胞に残存したそれらの多能性幹細胞を取り除き、移植後の腫瘍化の発生確率を抑えることに成功したと発表しました。
同成果は、NAIST 先端科学技術研究科 バイオサイエンス領域 幹細胞工学研究室の印東厚助教、同・栗崎晃教授らの研究チームによるものです。
詳細は、幹細胞の分子生物学研究に関する全般を扱う学術誌「Stem Cells Translational Medicine」に「EPHA2 is a novel cell surface marker of OCT4-positive undifferentiated cells during the differentiation of mouse and human pluripotent stem cells」のタイトルで論文として発表されました。
iPS細胞を使った医療のリスク
多能性幹細胞は再生医療への期待が高まっていますが、分化しきれなかった細胞（未分化細胞）の混入による腫瘍形成リスクに対する懸念は依然として残っています。
未分化細胞の移植によって生じる腫瘍の多くは良性の奇形腫であることが一般的に認識されていますが、正常な核型のマウスES細胞であっても、免疫不全マウスに移植すると奇形癌を発症する可能性があります。
これらの未分化細胞と腫瘍細胞の間には、増殖速度が速い、接触阻害がない、テロメラーゼ活性が高い、MYCやKLF4などのがん遺伝子の発現が高いなど、顕著な類似点があるため、未分化PSCがヒトのレシピエントへの移植プロセスに混入すると、良性の奇形腫ではなく悪性の奇形癌を発症するリスクシナリオが存在します。
したがって、効果的な幹細胞療法には、移植前に分化細胞から腫瘍形成細胞を除去することが不可欠です。
EPHA2とは？
この研究では、さまざまなマウスESCラインの表面でEPHA2の顕著な発現を観察しました。
EPHA2は正式名称がEPH receptor A2、他にもARCC2、CTPA、CTPP1、CTRCT6、ECKと呼ばれています。
また、Ephrin type-A receptor 2、Epithelial cell receptor protein tyrosine kinase、Tyrosine-protein kinase receptor ECKという名前も使われています。
EPH receptorは、Eph受容体と訳され、ファミリーを形成するタンパク質の一つで、細胞間のコミュニケーションに関与しています。
特に、細胞の成長、分化、移動、および組織の形態形成に重要な役割を果たしています。EPHA2は主に次のような機能を持ちます
EPHA2は、細胞が互いにどのように接触し、移動するかを調整するシグナル伝達経路に関与しています。
これは特に、発生過程や傷の治癒において重要です。
さらにEPHA2は、さまざまなタイプの癌において異常に発現していることが知られています。
EPHA2の過剰発現や機能異常は、癌細胞の増殖、浸潤、および転移を促進することが示されています。
このことから、EPHA2の研究は、特に癌治療の新しいターゲットとしての可能性から注目されています。
分子レベルで見ると、EPHA2は、EphrinA（エフリンA）リガンドと結合することにより、双方向性シグナル伝達を介して細胞内および細胞間のコミュニケーションを行います。
これは、「正の」シグナル（前向きシグナル）と「逆の」シグナル（逆向きシグナル）を通じて行われます。
EPHA2は、腫瘍の進行と胚発生の両方で顕著です。
マウス実験で証明されているように、EPHA2は血管、脊索、皮膚などの特定の組織で発現し機能することが認識されているため、これらの組織への適用には限界があります。
EPHA2は他の正常なヒト組織では中程度の発現を示しますが、腫瘍組織および癌細胞株では一般的な発現が見られます。
さらに、EPHA2レベルの上昇は、さまざまな癌の予後不良と関連しており、これは、腫瘍細胞の移動、浸潤、および転移におけるEPHA2の役割を示唆しています。
EPHA2は、かなりの細胞外ドメインを持つI型膜貫通タンパク質として分類されていることを考えると、有望な薬物ターゲットとなっています。
ただし、EPHA2を腫瘍細胞およびPSCに結び付ける正確なメカニズムはまだ完全に解明されていません。
本研究では、マウスES細胞の多能性を維持する上でのEPHA2の役割を明らかにしています。
また、マウスES細胞におけるEpha2の不在により分化マーカーの発現が大幅に促進されることも示しており、これは幹細胞を分化から保護するEpha2の役割を示しています。Epha2-ノックダウン後に観察された自発的な分化とEpha2-ノックダウン細胞の分化は、一貫して初期外胚葉マーカーSox1、中内胚葉マーカーT、初期中胚葉マーカーMixl1、および初期内胚葉マーカーGata6の発現を誘導しました。
これらの知見は、EPHA2が特定の系統への分化を選択的に抑制するのではなく、胚葉の指定の前の段階で分化を阻害することを示唆しています。
Epha2ノックアウトマウスES細胞に関する以前の研究では、マウスES細胞の多能性への影響は最小限であると提案されています。
逆に、この研究結果は、Epha2 ノックダウン後のマウス ESC における自発的な分化を強調しました。
こういった結果から、未分化細胞における EPHA2 の潜在的な機能は、未分化細胞の分化を制限することである可能性があります。
つまり、EPHA2の存在によって分化にブレーキがかかっているのかもしれないという仮説が成立します。
細胞膜表面のタンパク質に着目した理由
今回の研究では、まずはヒトiPSC由来肝細胞内の未分化OCT4 +細胞でヒトEPHA2を特定しました。
マウスおよびヒトの未分化細胞を肝細胞に分化させる確立された方法を用いて、EPHA2特異的抗体を使用し、これらの分化集団から奇形腫を形成できる未分化細胞を効果的に除去しました。
この研究結果は、EPHA2は残存する未分化細胞を特定するための確実な細胞表面マーカーであり、幹細胞移植後の腫瘍形成リスクを軽減する可能性があると示唆しています。
LIN28Aという遺伝子があります。
この遺伝子は分化細胞で発現が消失する遺伝子の1つであり、ヒトiPSC由来心筋細胞でドロップレットデジタルPCRを使用して残存する未分化細胞を検出できます。
さらに、マウスLin28aの有意な発現誘導がiPSCの誘導中に観察されており、今回研究グループが特定したEpha2に匹敵します。
しかし、LIN28Aは細胞内タンパク質であるため、移植のために未分化細胞を除去するのが困難です。
そのため、研究チームは細胞内タンパク質ではなく、数多くの膜タンパク質の特性を研究しました。
その結果が、がん化の可能性を持つ多能性幹細胞の指標となる今回のEPHA2を発見です。
同タンパク質は、健常者の体内ではほとんど存在せず、初期胚やガン細胞でのみに存在することが確認されていました。
また研究チームはこれまでの研究で、EPHA2がES細胞でも発現していることを解明していました。
細胞膜に埋め込まれる「膜タンパク質」は、細胞外に出ている部位を検出することで、遺伝子操作や侵襲をすることなく多能性幹細胞を捕捉することが可能です。
今回の研究はそういった観点から行われた研究です。
より効果的な細胞表面マーカーの必要性という再生医療でのハードルを今回の研究では下げることに成功しました。
この研究を基盤として、研究グループはEPHA2 とこれらの従来のマーカーを組み合わせて使用することを提案しています。
これにより、移植のために残留する未分化細胞をさらに広範囲に除去できるようになります。
この研究が意味するもの
iPS細胞などの幹細胞は、多様な細胞系統に分化する能力を本来備えており、再生医療の強力な手段となっています。
しかし、これらの幹細胞は移植後に奇形腫を生じやすいため、治療への利用には大きな障害となっています。
今回の研究チームは、プロテオーム解析により、多能性状態で特異的に発現する一連の細胞表面タンパク質を特定しました。
ここでは、未分化マウス未分化細胞の表面に豊富に存在し、分化時に減少するタンパク質であるEPHA2を特定しました。
そしてEpha2をノックダウンすると、マウス幹細胞が自発的に分化しました。
これは、EPHA2はマーカーとしての機能だけでなく、未分化細胞状態の維持におけるEPHA2の極めて重要な役割を示しています。
ヒトiPS細胞やマウスES細胞を分化させた「胚様体」(多能性幹細胞を浮遊培養することで形成される3次元の細胞凝集塊)の中には、しばしば分化していない多能性幹細胞が残存している場合があることが知られていました。
残存細胞には高い確率でEPHA2が発現していることが発見され、免疫不全マウスに胚様体を移植する実験では、EPHA2発現細胞を取り除くと、移植細胞から腫瘍の発生を大幅に抑制できることが確認されました。
今回の解析では肝臓細胞を用いた解析が行われたが、EPHA2が用いられた細胞の品質管理は、神経組織・肺・腎臓など他の臓器にも適用できる可能性が考えられるとしています。
