iPS細胞を使った検査系の開発
iPS細胞を誘導して作製した肺や気道の細胞に新型コロナウイルスを感染させて変異株の病原性を調べる手法を開発したと、京都大iPS細胞研究所の研究グループが発表しました。
新型コロナウイルス感染症だけでなく、インフルエンザなどほかの呼吸器感染症に応用できる検査系です。
この研究は、京都大学のCiRA臨床応用研究部門の後藤慎平教授、増井淳研究員、そしてCiRA増殖分化機構研究部門の高山和雄講師らによる研究グループによって行われました。
このグループが作ったのは肺でガス交換を担う「肺胞」や気道の表面を覆う上皮細胞の組織です。
ウイルスは細胞の「受容体」と結合することで感染しますが、従来の技術でiPS細胞から肺の組織を作ると受容体が組織の内側を向いてしまい、ウイルス感染させるには不向きでした。
この欠点を解決する事を目的にグループは独自の培養技術を開発し、細胞の受容体が外側を向いた組織を作ることに成功しました。
そしてこの肺や気道の組織にコロナの変異株を感染させて病原性を比較したところ、従来株やデルタ株はオミクロン株に比べて肺で増殖しやすいことが確認されました。
さらにデルタ株についてはアポトーシスを引き起こす作用も確認され、組織の縮小もみられ、ほかの株と比べて呼吸器へのダメージが大きいことが示唆されました。
この研究は、幹細胞関連論文で構成された国際学術誌である「Stem Cell Reports」に、「Micro-patterned culture of iPSC-derived alveolar and airway cells distinguishes SARS-CoV-2 variants」というタイトルの論文で発表されました。
研究のポイント
この研究のポイントは2つです。
- マイクロパターン培養によりiPS細胞から肺胞と気道の細胞を分化誘導する方法を確立。
- 新型コロナウイルスが肺胞や気道に感染するモデルを作製。
マイクロパターン培養とは、1つのウェルのなかに、細胞が接着する領域と接着しない領域が並んだ培養プレートを使って細胞培養をする方式です。
この研究で使用した培養プレートは、東ソー株式会社が開発したものを使用しています。
重症急性呼吸器症候群–コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）亜種の出現により、その病原性を迅速に評価するシステムが必要となりました。
ウイルスにおける遺伝子変異は、変異スピードが速いために次々と出現します。
そのため迅速な評価システムが必要となりました。
しかし侵入口の肺上皮細胞は入手先が限られていることに加え、ヒト肺胞上皮細胞の培養は特に複雑になっており、肺胞上皮細胞の培養は特に複雑です。
この研究では、SARS-CoV-2亜種を高分解能で識別するためのモデルとして、iPSC由来の肺胞細胞と気道細胞をマイクロパターン上で別々に誘導したものを用いています。
SARS-CoV-2亜種を高分解能で識別するモデルの必要性は高く、この実験・検査系は今後ニーズが高まると考えられています。
分化させた細胞は、自らがどの組織のどの部分を構築する細胞かを知らなければ正常な発生が行えません。
そのため、今回の実験系における位置特異的シグナルは、肺胞2型と多毛化した気道細胞を誘導するためのシグナルを用いました。
目的の気道細胞は、それぞれコロニーの周辺部と中心部に誘導され、各系統における感染研究により、SARS-CoV-2の病原性のプロファイリングが可能となりました。
iPS細胞からどう誘導するのか？
この研究では、AT2（Alveolar Type 2 cells）細胞が非常に重要です。
AT2細胞は肺の損傷を修復するうえで重要な体性幹細胞です。
これまで実験室での培養が試みられてきましたが、生体から取り出したAT2細胞を培養することは困難でした。
そのため現在ではiPS細胞を用いてAT2細胞を作製する方法が開発されています。
しかしiPS細胞由来のAT2細胞は、マトリゲルを使用した特殊な３次元オルガノイド培養法が必要ですが、オルガノイドのサイズを制御するのが難しく、直接的な解析も困難でした。
AT2細胞を具体的に見てみましょう。
AT2細胞は肺胞の中に存在する特定の細胞タイプです。
肺胞は肺の最小の構造単位であり、酸素と二酸化炭素の交換が行われる場所であり、AT2細胞は、肺胞において複数の重要な機能を担っています。
AT2細胞は、肺胞の表面張力を減少させるためのサーファクタントを産生します。
このサーファクタントは、肺胞の表面張力を下げることで、肺胞が開いたり閉じたりするのを助け、呼吸の効率を高めます。
さらにAT2細胞は、肺の損傷や病気の際に肺組織を修復するための幹細胞のような役割を果たすことが知られています。
これにより、肺の損傷や疾患から回復するプロセスが促進されます。
そしてAT2細胞は免疫応答にも関与しており、肺炎やその他の感染症に対する肺の免疫応答を調節することがあります。
これらの機能は、AT2細胞が肺の健康維持に重要な役割を果たしていることを示しています。
研究グループは、マイクロパターン培養を利用してiPS細胞由来の肺前駆細胞からAT2細胞への分化誘導を行いました。
AT2細胞が産生するサーファクタントタンパク質（SFTPC）が細胞内でできると、今回利用したiPS細胞内で緑色を発色してに検出できるようにGFP遺伝子導入をした細胞を用いました。
この培養系において、分化誘導後14日目には、線毛が動いている様子が観察されたほか、線毛上皮細胞の線毛を表すAc-Tubが細胞集団の表面に観察されました。
この実験系を使って作製された肺胞と気道の上皮細胞を利用して、それぞれ5種類のSARS-CoV-2（B.1.1.214株、B.1.617.2株=Delta株、BA.1株、BA.2株、BA.5株）を感染させて、培養上清中のSARS-CoV-2ゲノム量と細胞中遺伝子発現を調べました。
すると、2つの株（B.1.1.214株、B.1.617.2株）ではウイルスゲノム量が多かったのに対して、BA株=Omicron株では少ない傾向が見られました。
一方で、気道上皮細胞ではBA.5株がB.1.1.214株と同等のウイルスゲノム量を示したこと、細胞中遺伝子発現量ではBA.1株がB.1.617.2株と同等のウイルス遺伝子量だったことなど、変異株ごとの違いが定量的に示されました。
ここまで実験は遺伝子発現レベルでの結果ですが、タンパク質レベルでも研究グループは解析を行っています。
SARS-CoV-2感染をタンパク質レベルでの定量化を行うと、肺胞および気道の細胞マーカータンパク質と、SARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質（SARS-CoV-2 NP）が確認されました。
このタンパク質の実験結果によって、遺伝子解析と相関した結果をタンパク質レベルでも定量化出来ました。
次々と開発されるiPS細胞由来の実験系
この研究のように、人工的に準備することができない生体内の細胞をiPS細胞を作って作製し、様々な研究開発に使おうとする動きは少なくありません。
しかし大きな壁となるのがiPS細胞から分化誘導するときの培養条件の検討です。
iPS細胞から目的細胞を誘導するためには、それぞれの細胞に適した培養条件を準備する必要がありますが、この培養条件の探索が研究の重要なカギを握るため、多くの研究グループは培養条件の探索を中心に研究を進めています。
今回の研究成果はそういった研究の成功例の1つです。
呼吸器感染症の検査には、様々な手法があります。一般的な呼吸器感染症の検査には以下のようなものがあります。
Polymerase Chain Reaction（PCR）検査は、呼吸器感染症を引き起こす特定の病原体（ウイルスや細菌など）の遺伝子や核酸を検出するための非常に感度の高い方法です。
この検査は通常、鼻やのどの綿棒から採取された試料を使用して行われます。
抗原検査は、特定のウイルスや細菌のたんぱく質抗原を検出するために使用されます。
この検査はPCR検査よりも迅速であり、即座に結果を提供できる場合があります。
ただし、感度はPCR検査よりも低い場合があります。
抗体検査は、患者が過去に特定のウイルスや細菌に感染したかどうかを調べるために行われます。
これは主に病気の治癒後に使用されますが、病気の初期段階では正確性が低いことがあります。
呼吸器感染症の診断や治療を補完するために、X線やCTスキャンなどの画像検査が行われることがあります。これにより、肺の炎症や感染の程度を評価することができます。
これらは主に感染した個体に用いられる検査方法で、新しいウイルスが出現した場合にそのウイルスの個体への影響を検査する方法はなかなかありません。
マウス、ラットを使った感染検査では、毒性を検出することはできますが、ヒトの体に具体的にどのような影響が出現するかはわかりません。
そういった問題を一気に解決する検査方法の構築が求められていますが、今回の研究成果はそのうちの1つと言えます。
